骨骼肌是一種橫紋肌，通常是通過(guò)肌腱固定到骨骼上，其伸縮可以帶動(dòng)骨骼的移動(dòng)，促進(jìn)機(jī)體運(yùn)動(dòng)。

    肌細(xì)胞呈纖維狀，不分支，有明顯橫紋，核很多，且都位于細(xì)胞膜下方。肌細(xì)胞內(nèi)有許多沿細(xì)胞長(zhǎng)軸平行排列的細(xì)絲狀肌原纖維，每一肌原纖維都有相間排列的粗肌絲及細(xì)肌絲。肌纖維收縮并不是肌纖維中肌絲本身的縮短或卷曲，而是細(xì)肌絲在粗肌絲之間滑行的結(jié)果，肌絲滑行使肌節(jié)長(zhǎng)度縮短，肌原纖維縮短表現(xiàn)為肌纖維收縮。

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)開始前，將眼科剪刀、眼科鑷子、培養(yǎng)皿，15ml 離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無(wú)菌超凈工作臺(tái)，以紫外線照射 30min。

按照含 0.2%的 XI 膠原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的膠原酶進(jìn)行配制消化液，用0.22微米的 PES 微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，置于 50 毫升離心管中，可直接用于組織消化。瓶口消毒后室溫待用。

取出無(wú)菌培養(yǎng)皿，分別作好標(biāo)記，吸取適量 PBS 置于相應(yīng)標(biāo)記的培養(yǎng)皿中。

無(wú)菌條件下，準(zhǔn)備好各種大小的眼科剪刀、止血鉗、眼科鑷子和手術(shù)刀。將斷頸處死后浸泡于體積分?jǐn)?shù)為 75%乙醇的SD 大鼠仰臥在超凈臺(tái)內(nèi)的干凈培養(yǎng)皿上。

二、骨骼肌提取

眼科剪刀剪開大鼠后肢皮膚，暴露腿部肌肉，用手術(shù)刀小心割取后肢大腿肌肉，同樣方法分離另一后肢大腿肌肉。小心剪取表面無(wú)附著膜和脂肪組織的肌肉，置于裝有 PBS 的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。

吸取適量消化液于相應(yīng)標(biāo)記的培養(yǎng)皿中。

將剪取的骨骼肌在無(wú)菌 PBS 浸泡清洗，去除脂肪組織后放置于含消化液的培養(yǎng)皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌組織，成 1 平方毫米不規(guī)則碎片。

輕輕搖勻，室溫靜置消化 30 分鐘

收集組織懸液于 50 毫升離心管中，用消化液反復(fù)沖洗培養(yǎng)皿，直至將全部組織塊收集到離心管內(nèi)。

輕輕吹打混勻組織塊懸浮液.

配平離心：使用低速離心機(jī)每分鐘 1000 轉(zhuǎn)，室溫離心十分鐘。

三、骨骼肌懸液制備及培養(yǎng)

離心后小心去除上清，不要吸到底部的組織塊沉淀，用含 20%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基重懸，輕輕吹打混勻，制成懸液。

均勻轉(zhuǎn)移至六孔板中，輕輕搖勻，標(biāo)記時(shí)間后放于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為 5%的CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

本次實(shí)驗(yàn)采用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng) 1 小時(shí) 后，吸取上清液置于另一孔中繼續(xù)培養(yǎng)。

每隔一小時(shí)轉(zhuǎn)移一次，轉(zhuǎn)移 3-4 次。4 天后換液, 以后每天換液 1 次，直到增殖達(dá)到融合。

四、細(xì)胞觀察及鑒定

差速培養(yǎng)后，細(xì)胞 24 小時(shí)后開始貼壁,96 小時(shí)后貼壁，倒置顯微鏡下每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)特征，傳代培養(yǎng)純化至 P3 代用于后續(xù)試驗(yàn)。

采用 HE 染色和a-actin 染色進(jìn)行骨骼肌細(xì)胞鑒定。

結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)所用的消化液以及差速貼壁法可分離培養(yǎng)出純度高、活力旺盛的骨骼肌細(xì)胞。

五、注意事項(xiàng)

1、消化液的制備及消化時(shí)間

合適的消化液以及消化時(shí)間的把握, 是實(shí)驗(yàn)取材的關(guān)鍵：

合適的消化液利于骨骼肌細(xì)胞從基膜中釋放出來(lái)。

酶作用時(shí)間不足則獲得細(xì)胞較少,作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可致細(xì)胞受損、生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。

2、肌肉組織要盡可能剔除表面的膜和脂肪組織：

肌肉組織表明的膜和脂肪組織去除利于后續(xù)細(xì)胞的純化，減少傳代次數(shù)，獲得純度高的骨骼肌細(xì)胞。

3、纖維細(xì)胞的去除 :

本實(shí)驗(yàn)采用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng) 1 小時(shí)后移至另一孔進(jìn)行培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)移兩次，有效去除骨骼肌細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞。

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